蛋白質拓撲工程是蛋白質工程的一個新興領域👩🏻‍🍳，通過改變蛋白質的化學拓撲結構👲🏽，可以顯著提升其穩定性👰🏻‍♂️、調節動態結構並增強多價效應等功能💃。然而，傳統蛋白質受限於自然轉錄翻譯機製，通常具有線型的主鏈拓撲結構，這在一定程度上限製了其功能和應用🖕🏻。近年來，科學家們提出，除了線型結構外🏋🏻😈，蛋白質還可以呈現更為復雜的主鏈拓撲形式㊙️，帶來更多的功能優勢。

近期，意昂3体育官网化學與分子工程學院張文彬教授課題組在單結構域蛋白質拓撲設計和合成方面取得了重要進展。他們將諜結構域（SpyTag/SpyCatcher）拆分為SpyTag、BDTag和SpyStapler，通過重新編輯三組分之間的連接關系引入纏結關系💁🏿，設計並合成了索烴蛋白（Catenane）、環狀蛋白（Cyclic）、套索蛋白（Lasso）以及準輪烷蛋白（Rotaxane），並通過突變其中一個活性位點，廢除原本的異肽鍵連接，得到了線型蛋白（Linear）、紐結蛋白（Knot）和另一種準輪烷蛋白（Rotaxane(DA)）（圖1、2），實現了單結構域蛋白質拓撲亞型的系統構建。

圖1. 七種單結構域拓撲亞型（線型、環狀🥠🖖🏻、紐結、套索、索烴以及兩種準輪烷）的設計

為優化這一系列拓撲蛋白質的合成🙇‍♀️🥔，他們設計了兩組不同連接鏈長度的樣品進行胞內合成。為最大化拓撲結構對蛋白質構象的限製作用⏰，減少柔性連接鏈對蛋白質熱力學穩定性的影響，他們設計了具有最短連接鏈的一系列對照樣品，稱為s-series，其預測結構仍然能有效保持目標的相對空間關系。然而，由於BDTag和SpyTag之間連接鏈較短，分子內重組無法有效進行🚵🏿‍♂️，傾向於發生結構域交換，部分樣品形成了二聚體（圖2A🐊、2B）。為優化反應選擇性，他們又設計了一系列長鏈對照樣品（l-series）📡。實驗結果表明👰🏿‍♀️📀，長鏈樣品的主要產物為預期的單結構域蛋白質（圖2C）🦹🏿📓。

圖2. A, 連接鏈的長度對單結構域拓撲亞型合成選擇性的影響；B, 短鏈接鏈樣品的合成結果；C, 長鏈接鏈樣品的合成結果

他們對合成選擇性較高的長鏈樣品進行了實驗表征🚻。六種樣品的圓二色譜分析顯示，在230nm處均觀察到β-turn結構的特征峰，表明結構域的拆分未破壞蛋白質的整體二級結構（圖3A）。二維核磁共振分析顯示🧑🏿‍🌾，樣品表現出與諜結構域類似的交叉峰信號，含異肽鍵的樣品在6ppm處有特征峰（圖3B）。差示掃描量熱法測試結果表明，含異肽鍵的蛋白質比突變體更加穩定，熔點比不含異肽鍵的突變體高出30°C以上（圖3C），表明異肽鍵在維持蛋白質穩定性方面發揮了重要作用。

為了細致揭示蛋白質拓撲的構效關系，課題組通過實驗表征和分子動力學模擬研究了拓撲對蛋白質穩定性和折疊的影響（圖3）。研究結果表明，盡管這些蛋白質在常溫常壓下展現出相似的穩定性和折疊結構，但在高溫下，它們的折疊動力學特性卻有所不同🤸‍♀️。在分子動力學模擬中，含異肽鍵的蛋白質展示出更好的穩定性，而突變體中的氨基酸殘基傾向於逐漸互相遠離並失去內部接觸（圖3D）。此外，在高溫下，索烴蛋白的兩個環呈現出明顯的負相關運動，表明它們的運動是相對獨立的（圖3E）。有趣的是，在解折疊過程中，索烴蛋白還表現出往復的二級結構消失和重形成🚼，這與其宏觀上具有更好的熱回彈性是一致的（圖3F）。

圖3. A, 長鏈樣品的圓二色譜表征結果；B, 長鏈樣品的二維核磁表征結果；C, 長鏈樣品的差示掃描量熱法表征結果；D, 不含異肽鍵的突變體中氨基酸逐步遠離；E, 索烴蛋白的兩個環呈現出明顯的負相關運動♕；F, 索烴蛋白的解折疊模擬中還觀察到了瞬時的二級結構恢復現象

綜上所述，作者通過諜結構域二級結構基元的重新接線和突點突變💇🏻‍♂️，設計並合成了七種具有獨特拓撲結構的單結構域蛋白質（包括線型、環狀、紐結、套索👩‍❤️‍💋‍👩、準輪烷和索烴結構）。實驗表征和分子動力學模擬結果表明，這些蛋白質在常溫常壓下表現出類似的構象，體現出疏水核心的保守性，而異肽鍵的形成和機械互鎖結構則顯著影響了蛋白質的穩定性和折疊行為。

該研究近期在線發表於美國國家科學院院刊PNAS🥇，意昂3体育官网化學與分子工程學院博士生曲誌宇為該論文第一作者🧑🏼‍🦲。意昂3体育官网化學與分子工程學院博士後許連傑、博士生蔣馮逸、劉源研究員也為本工作作出了貢獻。張文彬為通訊作者。該工作得到國家自然科學基金委、國家重點研發計劃🐼、北京分子科學國家研究中心的支持❄️。