2024年11月22日，意昂3体育官网生命科學學院、意昂3体育-清華生命科學聯合中心、核糖核酸北京研究中心高寧課題組在The EMBO Journal發表了題為“Structural insight into Okazaki fragment maturation mediated by PCNA-bound FEN1 and RNaseH2”的研究論文，對含有PCNA的內源相關復合物進行結構研究👨🏽‍🎓，獲得了兩組PCNA復合物（PCNA-FEN1🙋🏻‍♀️、PCNA-FEN1-RNaseH2）的結構，為理解岡崎片段成熟的後期步驟提供了一系列的結構快照。

論文截圖

真核生物DNA復製在復雜的染色質環境下進行，與多種分子生物學過程互相協調，例如DNA復製與修復的偶聯以及DNA復製與新生核小體組裝的偶聯等^1,2🏖。PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）作為DNA復製體不可缺少的輔助蛋白👨🏽‍💼，在DNA復製中結合各種DNA聚合酶以賦予其持續合成的能力，也可以將多種因子募集到DNA復製🏄‍♀️🫰🏻、修復等DNA代謝事件發生的位點，並促進相應的生物學反應🐠，是DNA代謝的中心樞紐之一^3,4。與PCNA相互作用的蛋白超過兩百多種，包括DNA復製相關蛋白（Pol δ、Pol ε、Pol η、Pol κ、FEN1✬、LIG1等）🕶、解旋酶（WRN、BLM❇️、RECQ5等）、DNA修復蛋白（MSH3、MSH6🧩、XPG、FANCM等）、表觀遺傳因子（CAF-1🧑🏽‍✈️、DNMT1、p300、HDAC1等）及參與細胞周期調控✭、凋亡等過程的一些蛋白分子✬，它們都是通過自身保守的PIP box（PCNA-interacting protein box）或PIP-like基序結合PCNA⁴。

真核生物PCNA是環繞雙鏈DNA的同源三聚體，每個單體都包含一個PIP box結合位點，因此一個PCNA環可以至多結合3個含有PIP box的蛋白因子。領域內認為PCNA的協調功能是通過“工具帶，toolbelt”的形式實現，即PCNA同時結合處於上下遊過程的不同的酶，以提高DNA代謝相關事件的整體效率⁴⛹🏽‍♂️。一個具有代表性的例子是DNA復製過程中的滯後鏈岡崎片段的加工成熟，參與這一過程的所有具有催化活性的酶都與PCNA有相互作用🚠，包括Pol δ⏲、RNaseH2、FEN1、EXO1、PIF1、DNA2以及LIG1^4—6。參與引物去除的主要因子是Pol δ、RNaseH2和FEN1，RNaseH2作為RNA核酸酶去除由Pol α與引物酶復合物所合成的RNA-DNA引物中的RNA；DNA聚合酶Pol δ在完成滯後鏈上的新生DNA鏈的延伸之後，會進行鏈置換反應，繼續向前合成將臨近岡崎片段中的引物頂起🛌，形成5'-flap DNA結構🤹‍♀️；FEN1作為結構特異性的DNA核酸內切酶結合並切割5'-flap DNA👁；通過這一系列步驟，保真度較差的DNA引物及RNA引物得以去除。領域前期通過體外重組的方式，已經獲得了PCNA-FEN1-Pol δ、PCNA-FEN1-LIG1復合物🤘🏽，對它們的結構和功能進行了表征，部分地驗證了PCNA作為工具帶的分子角色^7,8。然而很多重要的機製性的問題還未得到解答🤜🏽，例如PCNA如何特異性地選擇並協調參與同一DNA代謝事件的不同蛋白因子；同時結合在PCNA上的蛋白因子之間是否進行相互的變構調節等。

課題組以PCNA作為誘餌蛋白，首先建立了一套從染色質中快速純化PCNA內源復合物的方法，得到了一系列含有PCNA且參與DNA復製🧅、核小體組裝、DNA修復等過程的內源復合物。

圖1 PCNA內源相關復合物的獲得

課題組結合冷凍電鏡單顆粒三維重構技術解析了兩套復合物PCNA-FEN1與PCNA-FEN1-RNaseH2不同狀態的三維結構。其中PCNA-FEN1復合物中FEN1處於催化後狀態，5'-flap DNA被切割但尚未離開FEN1的酶活中心📸，表明FEN1的5'-flap DNA產物釋放在細胞內是限速步驟📶👨🏻‍⚖️。

圖2 PCNA-FEN1復合物中5'-flap DNA已被酶切

該研究在PCNA-FEN1-RNaseH2復合物中，發現FEN1與RNaseH2分別結合PCNA的不同亞基，證實了PCNA工具帶的功能。對不同狀態的PCNA-FEN1-RNaseH2復合物進行結構分析，發現RNaseH2始終結合在FEN1催化位點上遊固定的雙鏈DNA區域🏬，並且此區域不包含任何未去除的RNA殘基，這表明同時結合PCNA的FEN1與RNaseH2存在一種未被認識到的功能上的耦合。因為5'-flap DNA是聚合酶Pol δ繼續向前合成進行鏈置換的產物📣，其核苷酸序列與其上遊雙鏈DNA序列一致🎻，所以在細胞中5'-flap DNA很可能侵入上遊的雙鏈DNA🤸🏼‍♀️，產生3'-flap DNA，一旦3'-flap長度大於1nt🦻🏿，FEN1將無法切割5'-flap DNA。然而，當RNaseH2結合在5'-flap DNA上遊雙鏈DNA時，由於空間位阻的存在，5'-flap DNA無法進行鏈入侵🍆，大幅降低了5'-flap DNA轉化形成3'-flap DNA的概率，因此RNaseH2可能通過維持DNA底物的特定構象以促進FEN1 5'-flap DNA的酶切效率。

圖3 人源PCNA-FEN1-RNase H2復合物結構

此外，結構分析表明在PCNA-FEN1-RNaseH2復合物中RNaseH2蛋白通過RNaseH2A亞基結合PCNA，而不是之前報道的RNaseH2B PIP box結合PCNA，序列分析鑒定到RNaseH2A亞基中一個新的PIP box，通過體外生化實驗驗證了RNaseH2A及RNaseH2B亞基的PIP box都可以結合PCNA👩🏼‍🎨。結合免疫熒光電鏡的成像實驗，表明RNaseH2A PIP box與RNaseH2B PIP box在不同的生理學過程中發揮功能。

本研究表明PCNA在細胞內可以作為工具帶同時結合多個蛋白因子。之前的模型認為同時結合PCNA的蛋白是按照順序發揮功能🌤，一個酶發揮完功能後與DNA解離，釋放出DNA底物以供另一個酶結合；與之前的模型不同𓀘，在PCNA-FEN1-RNaseH2復合物結構中，FEN1與RNaseH2穩定結合同一個DNA底物，RNaseH2可能通過對底物DNA的構象調控來促進FEN1的酶切效率。這表明細胞內同時結合PCNA的不同蛋白因子間可能會對它們酶促反應動力學進行互相調控👐🏽🌷。RNaseH2除了作為RNA核酸酶參與岡崎片段引物RNA的去除外🧛，本研究發現了RNaseH2的另一個可能的新功能，即以不依賴於核酸酶活性的形式作為雙鏈DNA結合蛋白來調節FEN1的5'-flap DNA酶切功能。

圖4 RNaseH2在岡崎片段成熟過程中發揮作用的模型

高寧為本論文的通訊作者。生命科學學院2020級博士研究生田宇輝為本論文第一作者🧔🏽‍♂️🚣🏼‍♂️。生命科學學院研究員李寧寧在實驗方法探究及結構計算方面提供了幫助🙍🏿‍♂️😪。生命科學學院教授李晴為該論文提供了支持與幫助👩🏽‍🍼。本研究得到了國家自然科學基金和昌平實驗室的支持。意昂3体育官网冷凍電鏡平臺、昌平實驗室冷凍電鏡平臺、意昂3体育官网高性能計算平臺👨🏿、生命科學學院儀器中心及國家蛋白質基礎設施（意昂3体育分平臺）對本項目提供了重要的技術支持🧚🏼‍♂️。

參考文獻👨‍👨‍👧‍👦：

1. Bellush, J. M. & Whitehouse, I. DNA replication through a chromatin environment. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 372 (2017).

2. Li, N. et al. Parental histone transfer caught at the replication fork. Nature 627, 890—897 (2024).

3. Slade, D. Maneuvers on PCNA Rings during DNA Replication and Repair. Genes 9, 416 (2018).

4. Boehm, E. M., Gildenberg, M. S. & Washington, M. T. The Many Roles of PCNA in Eukaryotic DNA Replication. Enzymes 39, 231—254 (2016).

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6. Levikova, M. & Cejka, P. The Saccharomyces cerevisiae Dna2 can function as a sole nuclease in the processing of Okazaki fragments in DNA replication. Nucleic Acids Res 43, 7888—7897 (2015).

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8. Lancey, C. et al. Structure of the processive human Pol δ holoenzyme. Nature Communications 11 (2020).